Ricostituzione della biosintesi degli alcaloidi indolici monoterpenici nella Nicotiana benthamiana ingegnerizzata dal genoma

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 949 (2022) Citare questo articolo

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Gli alcaloidi indolici monoterpenici (MIA) sono una classe diversificata di prodotti naturali vegetali che includono una serie di composti importanti dal punto di vista medicinale. Abbiamo deciso di ricostituire il percorso della strictosidina, un intermedio chiave di tutti i MIA, dal metabolismo centrale nella Nicotiana benthamiana. Uno svantaggio di questo ospite è che il suo ricco metabolismo di fondo determina la derivatizzazione di alcune molecole prodotte eterologa. Qui utilizziamo l'analisi trascrittomica per identificare le glicosiltransferasi che sono sovraregolate in risposta agli intermedi biosintetici e produrre linee vegetali con mutazioni mirate nei geni che le codificano. L'espressione del percorso MIA iniziale in queste linee produce un profilo di prodotto più favorevole. La biosintesi della strittosidina è stata ricostituita con successo, con le migliori rese ottenute dalla coespressione di 14 enzimi, di cui un importante enzima simile alla proteina del lattice (MLPL) di Nepeta (menta gatta) è fondamentale per migliorare il flusso attraverso la via iridoide. La rimozione delle glicosiltransferasi endogene non influisce sulle rese di strictosidina, evidenziando che il flusso metabolico degli enzimi della via verso un intermedio biosintetico stabile riduce al minimo la necessità di ingegnerizzare il metabolismo endogeno dell'ospite. La produzione di strictosidina in planta amplia la gamma dei prodotti MIA suscettibili di sintesi biologica.

L'applicazione di approcci di biologia sintetica all'ingegneria dei sistemi vegetali ha facilitato i progressi nel controllo e nell'espressione dei percorsi biosintetici, consentendo alle piante di fungere da telaio di produzione biochimica alternativo1,2. Un parente del tabacco, N. benthamiana3,4, è emerso come specie favorita per la produzione vegetale di proteine ​​farmaceutiche5 e per la ricostituzione del percorso metabolico2. I successi includono la produzione su scala grammo di triterpenoidi6 e la produzione su scala milligrammo di etoposidi7. Tuttavia, diversi studi hanno segnalato l'accumulo di prodotti collaterali non desiderati, presumibilmente prodotti dalle attività fuori bersaglio degli enzimi endogeni di N. benthamiana come ossidasi e glicosiltransferasi8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18. Sebbene l’attività degli enzimi endogeni sia stata sfruttata in alcuni studi per produrre nuove molecole9 o per compensare la mancanza di un enzima noto19, la derivatizzazione delle molecole rappresenta nella maggior parte dei casi uno svantaggio, poiché riduce la potenziale purezza e la resa del composto bersaglio.

Gli alcaloidi indolici monoterpenici (MIA) costituiscono un ampio gruppo di prodotti naturali di origine vegetale di cui ne sono stati identificati oltre 300020. Questa classe di molecole comprende molti composti di valore medicinale usati per trattare la dipendenza, le malattie cardiache, la demenza, il dolore, il cancro, la malaria e il diabete. La pianta produttrice di MIA meglio caratterizzata è Catharanthus roseus (pervinca del Madagascar), che produce oltre 130 MIA tra cui la vinblastina e la vincristina bioattive, che vengono utilizzate come chemioterapie. Tuttavia, queste preziose molecole sono presenti in basse concentrazioni in C. roseus (0,0005% del peso secco)21, il che ne limita la disponibilità. La coltivazione in massa di cellule di C. roseus è fattibile, ma non è ancora stata segnalata una linea cellulare che produca costantemente queste molecole antitumorali22. Sebbene siano stati descritti metodi per l’espressione transitoria23 e la trasformazione genetica stabile24 delle piante di C. roseus, l’ingegneria genetica della pianta ospite nativa per aumentare la resa di questi composti rimane tecnicamente difficile. Inoltre, la complessità strutturale di molti MIA rende la sintesi chimica spesso impegnativa25,26. Di conseguenza, sono auspicabili percorsi alternativi per la produzione e la recente scoperta di passaggi mancanti nel percorso della vinblastina27,28 rende la ricostruzione del percorso in un ospite eterologo un'opzione sempre più attraente.

Il raggiungimento della produzione di quantità terapeuticamente utili di MIA richiede l’ingegneria del percorso per massimizzare il flusso metabolico attraverso le prime parti del percorso. La strictosidina è l'ultimo intermedio biosintetico comune da cui derivano tutti gli oltre 3000 MIA conosciuti. La ricostituzione del suo percorso biosintetico di circa 11 fasi nei microrganismi può richiedere un'ampia messa a punto delle condizioni di espressione dell'enzima e l'ottimizzazione del ceppo29, ad esempio, la scarsa espressione di geraniolo 8-idrossilasi (G8H) ha ostacolato la produzione di strictosidina nel lievito30. Ottenere rese utili di molecole come la vinblastina, che richiederebbe l’espressione di ulteriori 16+ enzimi oltre alla strictosidina, richiederà probabilmente un’ingegneria sostanziale, sebbene il lievito sia stato recentemente progettato per produrre ajmalicina attraverso l’integrazione genomica di 29 cassette di espressione, dimostrando la potenziale per la ricostruzione eterologa dello sforzo di percorsi biosintetici dei prodotti naturali vegetali31.